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"Lehrbuch
der medizinischen Mikrobiologie" Methoden zur Virusreinigung Bevor die Zusammensetzung eines Virus analysiert werden kann, ist es nötig, eine genügend hohe Konzentration von einheitlichen Viruspartikeln zu präparieren, die möglichst vollständig von Begleitstoffen aus der Wirtszelle gereinigt sein müssen. Zur Virusreinigung werden die üblichen Verfahren der makromolekularen Chemie eingesetzt, wie die verschiedenen Methoden der Ultrazentrifugation, der Chromatographie, Elektrophorese u.a. Auf die Ultrazentrifugation soll kurz eingegangen werden, da sie in der Virologie weiteste Verwendung gefunden hat. Der erste Schritt besteht bei der Virusreinigung oft in der Differentialzentrifugation des Rohmaterials (z.B. Zellhomogenat): Durch abwechselndes Zentrifugieren bei hohen und niedrigen Drehzahlen werden dann bereits viele Verunreinigungen des Virus abgetrennt. So läßt eine mehrstündige Zentrifugation bei 30.000 bis 50.000 Umdrehungen/Min. (UpM) die Viren zusammen mit teilchenartigen Zellkomponenten sedimentieren, während lösliche Komponenten im Überstand verbleiben, der verworfen wird. Das Sediment wird in neuem Puffer aufgenommen und für kürzere Zeit mit 5.000 - 10.000 UpM zentrifugiert. Jetzt sedimentieren Membranen, Zelldetritus usw., während das Virus im Überstand verbleibt, mit dem nun weitergearbeitet wird. Überschichtet man diese teilweise gereinigte Präparation in einem Zentrifugenröhrchen auf eine Zuckerlösung nach zentrifugal ansteigender Konzentration (Saccharose-Gradient) und zentrifugiert hochtourig, wo wandern die einzelnen Bestandteile entsprechend ihrer Sedimentationsraten verschieden rasch in den Gradienten ein und bilden sog. Banden oder Zonen, die durch die Zuckerlösung stabilisiert werden (Zonenzentrifugation) (Abb. 140). Die virushaltige Bande kann nun isoliert werden und durch einen Gradienten aus Salz hoher Dichte (z.B. Cäsiumchlorid) bis zm Gleichgewicht zentrifugiert werden. Diese sog. isopyknische Gleichgewichtszentrifugation trennt die Bestandteile nicht nach der Sedimentationskonstante, sondern nach ihrer unterschiedlichen Schwebedichte. Die Methode ist so empfindlich, daß noch Teilchen mit verschiedenem Nukleinsäuregehalt oder Nukleinsäuren verschiedener Konformation oder Basenzusammensetzung voneinander getrennt werden können. Durch solche Verfahren, die oft noch mit anderen, oben genannten Techniken (Chromatographie, serologische Methoden usw.) kombiniert werden können, erhält man weitgehend gereinigte Viruspräparationen. Einen ersten Anhalt über den Reinheitsgrad kann man durch eine elektronenmikroskopische Aufnahme gewinnen.
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